脲酶（Urease， UE）測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                    微量法100管/48樣

注    意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

UE能夠水解尿素，產(chǎn)生氨和碳酸。UE活性與有機(jī)物質(zhì)含量、全氮和速效氮含量呈正相關(guān)，反應(yīng)了氮素狀況。

測(cè)定原理：

利用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定脲酶水解尿素產(chǎn)生的NH₃-N。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、甲苯（不允許快遞）和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：粉劑×1瓶，臨用前加入9mL蒸餾水，充分溶解待用，4℃保存；用不完的試劑4℃保存；

試劑二：液體22mL×1瓶，4℃保存；

試劑三A液：液體×1支，4℃保存；試劑三B液：液體×1瓶，4℃保存；臨用前將A液倒入B液中混合，待用；用不完的試劑4℃保存一周；

試劑四：液體2mL×1瓶，4℃保存；

樣本的前處理：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至578nm，蒸餾水調(diào)零。

2、酶促反應(yīng)

混勻，放入37℃水浴1h后，10000g 25℃離心10min，取上清液。

2、將上清液稀釋10倍（取0.1mL上清液，加入0.9mL蒸餾水）。

3、測(cè)氨量（在微量石英比色皿或96孔板中加入下列試劑）

充分混勻，室溫放置20min

混勻，于578nm處，蒸餾水調(diào)零，讀吸光值A，計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

UE活力計(jì)算

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 0.0915x +0.0373；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL），y為吸光值A。

1、血清（漿）UE活力的計(jì)算:

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘產(chǎn)生1μg NH₃-N定義為一個(gè)酶活力單位。

UE活力（μg/min/mL）＝(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反總÷V樣÷T=27.32×(ΔA -0.0373)

單位的定義：每天每g土樣中產(chǎn)生1μg NH₃-N定義為一個(gè)酶活力單位。

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中1μg NH₃-N活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1μg NH₃-N定義為一個(gè)酶活力單位。

UE活力（μg/min/mg prot）＝(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反總÷(V樣×Cpr)÷T =27.32×(ΔA -0.0373) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1μg NH₃-N定義為一個(gè)酶活力單位。

UE活力（μg/min/ g 鮮重）＝(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷T =27.32×(ΔA -0.0373) ÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1μg NH₃-N定義為一個(gè)酶活力單位。

UE活力（μg/min/10⁴ cell）＝(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反總÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.0546×ΔA

10：稀釋倍數(shù)；T：反應(yīng)時(shí)間，60min； V反總：反應(yīng)體系總體積：0.3mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL；V樣總：提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量， g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 0.04575x +0.0373；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL），y為吸光值A。

1、血清（漿）UE活力的計(jì)算:

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘產(chǎn)生1μg NH₃-N定義為一個(gè)酶活力單位。

UE活力（μg/min/mL）＝(ΔA-0.0373) ÷0.04575×10×V反總÷V樣÷T=54.64×(ΔA -0.0373)

單位的定義：每天每g土樣中產(chǎn)生1μg NH₃-N定義為一個(gè)酶活力單位。

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中1μg NH₃-N活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1μg NH₃-N定義為一個(gè)酶活力單位。

UE活力（μg/min/mg prot）＝(ΔA-0.0373) ÷0.04575×10×V反總÷(V樣×Cpr)÷T =54.64×(ΔA -0.0373) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1μg NH₃-N定義為一個(gè)酶活力單位。

UE活力（μg/min/g 鮮重）＝(ΔA-0.0373) ÷0.04575×10×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷T =54.64×(ΔA -0.0373) ÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1μg NH₃-N定義為一個(gè)酶活力單位。

UE活力（μg/min/10⁴ cell）＝(ΔA-0.0373) ÷0.04575×10×V反總÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.1092×ΔA

10：稀釋倍數(shù)；T：反應(yīng)時(shí)間，60min； V反總：反應(yīng)體系總體積：0.3mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL；V樣總：提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量， g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。