病毒性神經(jīng)壞死病病毒染料法RT-PCR試劑盒

商品名稱：病毒性神經(jīng)壞死病病毒染料法RT-PCR試劑盒

Name     ：Viral Nervous Necrosis Virus(VNNV) SYBR qRT-PCR Kit

病毒性神經(jīng)壞死病病毒(Viral Nervous Necrosis Virus，VNNV)是一種RNA病毒，會(huì)引起病毒性神經(jīng)壞死病，流行于除美洲和非洲外幾乎世界所有地區(qū)的海水魚類，對(duì)仔魚和幼魚危害很大，嚴(yán)重者在一周內(nèi)死亡率可達(dá)100%，且近年受感染的魚類種類和受危害程度迅速增加，帶來重大經(jīng)濟(jì)損失，因此快速準(zhǔn)確鑒定對(duì)該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用。本產(chǎn)品基于PCR原理開發(fā)。它具有下列特點(diǎn)：

1. 一站式，用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對(duì)照。

2. 根據(jù)病毒性神經(jīng)壞死病病毒的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物，具有良好的特異性。

3. 基于染料法qRT-PCR檢測(cè)，靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10-100倍，可以達(dá)到至少1000拷貝/反應(yīng)。

4. 使用一管式qRT-PCR技術(shù)，RT和PCR兩步在一個(gè)試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。

5. 本產(chǎn)品足夠50次30μL體系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于臨床。

【試劑組成】

【儲(chǔ)存條件及有效期】

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為12個(gè)月。陽性對(duì)照需要因易污染其他成分需要單獨(dú)放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供RNA片段作為陽性對(duì)照。

【自備試劑】樣品RNA

【使用方法】

一、稀釋陽性對(duì)照（以10E2-10E7這6個(gè)10倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原。

1.       標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入45 μL 熒光PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

2.      在7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對(duì)照(本試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。

3.      換槍頭，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。

4.      換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。

二、樣品RNA的制備

5.       如果有N個(gè)樣品，必須設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?span>10μL上步制備的陽性對(duì)照梯度稀釋液中的第4號(hào)（濃度為1×10E4拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽性對(duì)照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）。可以用水作為制備的陰性對(duì)照。

6.      用自選方法純化N+2個(gè)樣品的RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。

三、設(shè)置RT-PCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）

如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，

7.       1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于PCR陽性對(duì)照（用第4號(hào)陽性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把6個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)縮減成1個(gè)，其余不變。

8.      在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加）：

注:需使用ROX染料I的機(jī)型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。需使用ROX染料II的機(jī)型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。

不需要使用ROX的機(jī)型：Thermal Cycle Dice Real Time System， LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。

9.       上機(jī)后按下面參數(shù)進(jìn)行RT-PCR（參數(shù)可能會(huì)因儀器不同而需優(yōu)化）。

四、數(shù)據(jù)處理

10.       如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。

       11.     如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。