本產(chǎn)品是基于熒光染料檢測的即用型 RT-PCR 試劑盒，可以對靶 RNA 分子進(jìn)行實時定量RT-PCR 分析（quantitative RT-PCR、qRT-PCR）。產(chǎn)品含有經(jīng)過優(yōu)化的緩沖液組分、逆轉(zhuǎn)錄酶、熱啟動 Taq DNA 聚合酶、Taq DNA 穩(wěn)定劑、dNTPs、MgCl2 和穩(wěn)定劑等所有實時定量 RT-PCR 所需要的成分，用戶只需加入 RNA 模板和引物即可進(jìn)行染料法實時定量 RT-PCR 反應(yīng)，具有廣泛的用途。

中文名稱：一步式染料法qRT-PCR試劑盒

英文名稱：One-Step SYBR qRT-PCR Kit

規(guī)格及成分

低溫運(yùn)輸，-20℃保存, 不凍融時保存期限為 12 個月。如果需要每天使用，可在 4℃放置三周。

自備試劑：RNA 模板、引物、超純水。

一步式染料法qRT-PCR試劑盒具有下列特點：

1.以 2×Mix 提供，用戶只需準(zhǔn)備模板、引物和 ROX 染料（取決于 qPCR 儀器）即可以進(jìn)行染料法實時定量 RT-PCR 實驗，非常方便快捷，降低了操作誤差。 2.各成分的濃度和比例都經(jīng)過精心優(yōu)化，反應(yīng)的靈敏度高，特異性強(qiáng)。靈敏度最高時可以達(dá)到 50 拷貝/反應(yīng)（跟模板質(zhì)量，引物設(shè)計等相關(guān)）。3.靈敏度和專一性比常規(guī) RT-PCR 更高。 4.可用于基因表達(dá)分析、SNP 分析、拷貝數(shù)分析等實驗。也可以用于定性檢測。5.本產(chǎn)品只能用于科研，1mL 足夠 100 次 20uL 體系的染料法 qRT-PCR 反應(yīng)。

使用方法:

如果有 N 個樣品并且做定量分析，最好設(shè)置 N+7 個反應(yīng)，多出的 7 個中，6 個是做標(biāo)準(zhǔn)曲線的陽性對照，一個是陰性對照（NC）。在 N+7 個 PCR 管中，加入下列成分。如果是做定性分析，則 6 個做標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品縮減成一個陽性對照（PC），用戶自己需要根據(jù)下表進(jìn)行適當(dāng)修改（把 6 個標(biāo)曲反應(yīng)改成 1 個陽性對照反應(yīng)）。

成分N 個樣品管6 個標(biāo)準(zhǔn)曲線管NC 管2×染料法 qRT-PCR 緩沖液 各 10 uL 各 10 uL 10 uL自備引物 1（10uM） 各 1 uL 各 1 uL 1 uL自備引物 2（10uM） 各 1 uL 各 1 uL 1 uLN 個自備模板 RNA 各 1-2 uL 不加 不加自備陽性對照模板（6 個梯度） 不加 各 1 uL（1 管加 1 個梯度） 不加陰性對照模板（水） 不加 不加 1 uL自備 50×ROX I 染料或自備 50×ROX II 染料（見注）各 0.4 uL 各 0.4 uL 0.4 uL10×染料法 qRT-PCR 酶混合液 2 uL 2 uL 2 uL補(bǔ)超純水到 20 uL 20 uL 20 uL

注，下列信息僅供參考，具體以 qPCR 儀器的使用手冊為準(zhǔn)。1、不需要 ROX 的機(jī)型：Agilent MX3000 和 MX4000、iCycler IQ、LightCycler 480、，、Smart Cycler System、Thermal Cycler Dice Real Time System 等型號的熒光 PCR 儀器不需要加 ROX 染料，但加入的話也不會影響整個 PCR 分析。2、需要使用 ROX I 的機(jī)型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step One、StepOne Plus。3、需要使用 ROX II 的機(jī)型：ABI Prism7500、7500 Fast、MJ Opticon、MJ Chromo4、Corbett RotorGene 3000。2. 放入熒光 PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增, 下表的擴(kuò)增參數(shù)僅供參考，一定需要根據(jù)靶分子長度，引物的 Tm 值等進(jìn)行調(diào)節(jié)。一般選擇三步法 PCR：

數(shù)據(jù)處理如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性。一般情況下，陰性對照 Ct 大于或等于 40（閾值需要以陰性對照的 Ct 值確定，此處為便于敘述以 40 為例，具體情況很可能閾值不一樣）。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。