多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）試劑盒說明書

                                      微量法100管/48樣

注   意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：                           

PPO（EC1.10.3.1）主要存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是一種含銅的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化產(chǎn)生醌，從而引起褐化，與果蔬加工、茶葉品質(zhì)和組培等密切相關(guān)。

測(cè)定原理：

PPO能夠催化鄰苯二酚產(chǎn)生醌，后者在525nm有特征光吸收。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：20mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：5mL×1瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）或果汁樣本的處理：

按照血清（漿）或果汁體積（mL）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議取0.1mL血清（漿）或果汁加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至525nm，蒸餾水調(diào)零。

2、  樣本測(cè)定（在EP管中依次加入下列試劑）

37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃（其它物種）中準(zhǔn)確水浴10min后，95℃水浴5min，冷卻至室溫，10000g，25℃離心10min，收集上清，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中，525nm處檢測(cè)測(cè)定管和對(duì)照管吸光度，計(jì)算ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照。

注意：煮沸樣本的操作：取300μL離心上清于EP管中，進(jìn)行5min 95℃水浴處理；每個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管，可以在不同對(duì)照管中加入不同樣品的粗酶液，然后集中進(jìn)行5min 95℃水浴處理。

PPO活性計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）或果汁PPO活性

單位的定義：每分鐘每mL血清（漿）或果汁在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化

0.01為一個(gè)酶活力單位。

PPO（U/mL）=ΔA×V反總÷(V液× V樣÷V樣總)÷0.01÷T =60×ΔA÷V液

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞PPO活性

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個(gè)

酶活力單位。

PPO（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.01÷T =60×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每分鐘每g組織在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個(gè)

酶活力單位。

PPO（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T =60×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每分鐘每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

PPO（U/10⁴ cell）=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T =0.12×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.3mL；V液：加入血清（漿）或果汁體積，0.1mL； V樣：加入樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）或果汁PPO活性

單位的定義：每分鐘每mL血清（漿）或果汁在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化

0.005為一個(gè)酶活力單位。

PPO（U/mL）=ΔA×V反總÷(V液× V樣÷V樣總)÷0.005÷T =120×ΔA÷V液

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞PPO活性

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個(gè)

酶活力單位。

PPO（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.005÷T =120×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每分鐘每g組織在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個(gè)

酶活力單位。

PPO（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.005÷T =120×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每分鐘每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個(gè)酶活力單位。

PPO（U/10⁴ cell）=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.005÷T =0.24×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.3mL；V液：加入血清（漿）或果汁體積，0.1mL； V樣：加入樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。