線粒體轉(zhuǎn)氫酶-2（TH-2）試劑盒說明書

                                      微量法100管/96樣

注  意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

TH位于線粒體的內(nèi)膜上，又稱為線粒體復(fù)合體六，催化NADH+NADP⁺和NAD⁺+NADPH相互轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)線粒體NAD(H)和NADP(H)平衡。把逆向反應(yīng)稱為TH-2，催化NADPH和NAD⁺生成NADP⁺和NADH。

測(cè)定原理：

NADH和NADPH均在340nm有特征吸收，因此TH催化的轉(zhuǎn)氫反應(yīng)不能導(dǎo)致340nm吸光度發(fā)生變化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸（APAD⁺）替代NAD⁺，TH-2催化APAD⁺還原生成APADH，APADH在375nm有特征光吸收，測(cè)定375nm光吸收的增加速率，來計(jì)算TH-2活性。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：液體50mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：液體18mL×1瓶，4℃保存；

試劑四：粉劑×1支，-20℃保存；

試劑五：粉劑×1支，-20℃保存；

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

①        準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細(xì)胞，加入1mL試劑一，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

②        將勻漿600g，4℃離心5min。

③        棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

④        上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的TH-2（此步可選做）。

⑤        步驟④中的沉淀即為線粒體，加入500uL試劑二，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次），用于TH-2活性測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至375nm，蒸餾水調(diào)零。

2、  樣本測(cè)定

（1）工作液的配制：臨用前將試劑四、五轉(zhuǎn)移到試劑三中混合溶解，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL樣本和180μL工作液，混勻，立即記錄375nm處初始吸光值A1和 10min后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

TH-2活性計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADH定義為一個(gè)酶活性單位。

 TH-2活性（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr)÷T=149×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADH定義為一個(gè)酶活性單位。

TH-2活性（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=74.5×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADH定義為一個(gè)酶活性單位。

TH-2活性（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.149×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：APADH摩爾消光系數(shù)，6.7×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02 mL；V樣總：加入提取液體積，0.5mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADH定義為一個(gè)酶活性單位。

 TH-2活性（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr)÷T=298×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADH定義為一個(gè)酶活性單位。

TH-2活性（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=149×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADH定義為一個(gè)酶活性單位。

TH-2活性（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.298×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：APADH摩爾消光系數(shù)，6.7×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.02 mL；V樣總：加入提取液體積，0.5mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。