丙酮酸（pyruvic acid PA）含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                          微量法100管/96樣

注    意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

丙酮酸通過(guò)乙酰CoA連接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代謝，起著重要的樞紐作用。

測(cè)定原理：

丙酮酸與2,4-er硝ji苯肼作用，生成丙酮酸-2,4-er硝基苯腙，在堿性溶液中呈顯色。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體2.5mL×1瓶， 4℃保存；

試劑二：液體12.5mL×1瓶， 4℃保存。

丙酮酸提取：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次），靜置30min， 8000g，25℃離心10min，取上清待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿，靜置30min，8000g，25℃離心10min，取上清待測(cè)。

3、血清（漿）樣品：按照血清（漿）體積（mL）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議取0.1mL血清（漿）加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿，靜置30min， 8000g，25℃離心10min，取上清待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至520nm，蒸餾水調(diào)零。

2、在微量石英比色皿或96孔板中加入75μL樣本和25μL試劑一，混勻，靜置2min，加入125μL試劑二，混勻，于520nm波長(zhǎng)處測(cè)定管吸光值A。

丙酮酸含量計(jì)算：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 0.0466x + 0.0675； x為丙酮酸含量（µg/mL），y為吸光值。

2、按照血清（漿）體積計(jì)算

丙酮酸含量（μg/mL）= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷（V3×V1÷V2）=214.6×(A-0.0675)

3、按照蛋白濃度計(jì)算

丙酮酸含量（μg/mg prot）=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(V1×Cpr)=21.46×(A-0.0675) ÷Cpr

4、按照樣品質(zhì)量計(jì)算

丙酮酸含量（µg/g鮮重）= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(W ×V1÷V2）=21.46×(A-0.0675) ÷W

3、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

丙酮酸含量（μg/10⁴ cell）＝[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷（500×V1÷V2）=0.043×(A-0.0675)

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.075mL；V2：加入提取液體積，1 mL；V3：加入血清（漿）體積，0.1 mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。

b. 用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 0.0233x + 0.0675； x為丙酮酸含量（µg/mL），y為吸光值。

2、按照血清（漿）體積計(jì)算

丙酮酸含量（μg/mL）= [(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷（V3×V1÷V2）=429.2×(A-0.0675)

3、按照蛋白濃度計(jì)算

丙酮酸含量（μg/mg prot）=[(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷(V1×Cpr)=42.92×(A-0.0675) ÷Cpr

4、按照樣品質(zhì)量計(jì)算

丙酮酸含量（µg/g鮮重）= [(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷(W ×V1÷V2）=42.92×(A-0.0675) ÷W

3、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

丙酮酸含量（μg/10⁴ cell）＝[(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷（500×V1÷V2）=0.086×(A-0.0675)

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.075mL；V2：加入提取液體積，1 mL；V3：加入血清（漿）體積，0.1 mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。

注意：Z低檢測(cè)限為1μg/mL或1μg/g鮮重或10ng/mg prot