磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC)試劑盒說明書

                                          微量法100管/96樣

注    意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

PEPC（EC 4.1.1.31）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和細(xì)胞中，是催化磷酸烯醇式丙酮酸與二氧化碳反應(yīng)生成草酰乙酸呈不可逆反應(yīng)的酶，對(duì)三羧酸循環(huán)的運(yùn)轉(zhuǎn)起重要調(diào)節(jié)作用。

測(cè)定原理：

PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸和CO₂生成草酰乙酸和HPO4^2-，蘋果酸脫氫酶進(jìn)一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD⁺，在340nm測(cè)定NADH減少速率，計(jì)算PEPC活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體15 mL×1瓶， 4℃保存；

試劑二：粉劑×2瓶，-20℃保存；

試劑三 ：原液10μL×1支，4℃保存；

試劑三：稀釋液5mL×1瓶，4℃保存；

樣本的前處理：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟和加樣表：

1、   分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、   樣本測(cè)定

（1）取試劑二瓶一瓶，加入6mL試劑一和4.2mL蒸餾水充分混勻，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴5min；現(xiàn)配現(xiàn)用。

（2）試劑三工作液的配制：將試劑三原液：試劑三稀釋液=1μL:329μL稀釋，混勻，用多少配多少。

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、20μL試劑三、170μL試劑二，混勻，立即記錄340nm處20s時(shí)的吸光值A1和5min20s后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

PEPC活性計(jì)算：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）PEPC活力計(jì)算

單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPC（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=643×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PEPC活力計(jì)算

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPC（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=643×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每1萬個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPC（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=1.286×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。

b. 用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）PEPC活力計(jì)算

單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPC（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=1286×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PEPC活力計(jì)算

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPC（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=1286×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每1萬個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPC（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=2.572×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。