丙酮酸脫氫酶（Pyruvate dehydrogenase，PDH）試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                        微量法100管/96樣

注   意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

PDH（EC 1.2.4.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDHC)催化丙酮酸氧化脫羧的限速酶，催化丙酮酸脫梭生成羥乙-基-TPP，把糖酵解和三羧酸循環(huán)連接起來(lái)。

測(cè)定原理：

PDH催化丙酮酸脫氫，同時(shí)還原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），從而導(dǎo)致600nm光吸收的減少。

需自備的儀器和用品

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：100mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：20mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：1.5mL×1支，-20℃保存；

試劑四：液體20mL×1瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存；

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、   稱(chēng)取約0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、   將勻漿600g，4℃離心5min。

3、   棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

4、   上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的PDH（此步可選做）。

5、   在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于線粒體PDH活性測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至605nm，蒸餾水調(diào)零。

2、  樣本測(cè)定

（1）在試劑五中加入19mL試劑四充分溶解，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL試劑五，混勻，立即記錄605nm處初始吸光值A1和 1min后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

PDH活性計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

 PDH活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=952×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

PDH活性（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=192×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

PDH活性（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.385×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

 PDH活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1904×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

PDH活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=384×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

PDH活性（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.77×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×10⁴ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。