中性轉(zhuǎn)化酶（Neutral invertase, NI）試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                         微量法100管/48樣

注   意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

蔗糖轉(zhuǎn)化酶（Invertase，Ivr）催化蔗糖不可逆地分解為果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖代謝關(guān)鍵酶之一。根據(jù)最適 pH，將高等植物Ivr分為酸性轉(zhuǎn)化酶（AI）和中性轉(zhuǎn)化酶（NI）兩種類型。                          

NI主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，負(fù)責(zé)分解細(xì)胞質(zhì)中蔗糖為果糖和葡萄糖。

測(cè)定原理：

NI催化蔗糖分解產(chǎn)生還原糖，進(jìn)一步與3,5－二硝基水楊酸反應(yīng)，生成棕紅色氨基化合物，在510nm有特征光吸收，在一定范圍內(nèi)510nm光吸收值與還原糖生成量成正比。通過(guò)光吸收增加速率來(lái)計(jì)算NI活性

自備用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存;

試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存;

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入10mL試劑一充分溶解備用；用不完的試劑4℃保存；

試劑三：液體15mL×1瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。12000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟和加樣表：

1、   分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至510nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定，（在EP管中依次加入下列試劑）：

混勻， 37℃準(zhǔn)確水浴30min后，95℃水浴10min（蓋緊，以防止水分散失），流水冷卻后充分混勻（以保證濃度不變）

混勻，95℃水浴10min（蓋緊，以防止水分散失），流水冷卻后充分混勻，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中， 510nm處記錄各管吸光值A，如果吸光值大于2，可以用蒸餾水稀釋后測(cè)定（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)），ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

NI活性計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 0.0016x -0.001；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL），y為吸光值。

（1）按蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：37℃每mg蛋白每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。

NI活性（μg/min /mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷Cpr

（2）按鮮重計(jì)算：

單位的定義：37℃每g組織每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。

NI活性（μg/min /g 鮮重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(W×V1÷V2) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷W

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05mL；V2：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 0.0008x -0.001；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL），y為吸光值。

（1）按蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：37℃每mg蛋白每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。

NI活性（μg/min /mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=41.6×(ΔA +0.001) ÷Cpr

（2）按鮮重計(jì)算：

單位的定義：37℃每g組織每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。

NI活性（μg/min /g 鮮重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(W ×V1÷V2) ÷T =41.6×(ΔA +0.001) ÷W

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05mL；V2：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。