肝酯酶（Hepatic lipase，HL）試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法100T/48S

注       意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

肝酯酶是脂肪分解酶，在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中合成，存在于肝臟竇周間隙內(nèi)皮細(xì)胞表面和竇周間隙腔面的肝細(xì)胞微絨毛表面，可促進(jìn)脂蛋白中的膽固醇向類(lèi)固醇激素轉(zhuǎn)化，血漿中的HL活性增高時(shí)，血漿中小顆粒可導(dǎo)致LDL水平升高，加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。

測(cè)定原理：

肝酯酶水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生α-萘酚，可與固藍(lán)B鹽形成紫紅色偶氮化合物，在595nm有特征吸收峰，顏色深淺在一定范圍內(nèi)與肝酯酶活性成正相關(guān)。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、冷凍離心機(jī)、研缽、水浴鍋、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板。

試劑組成和配制 ：

試劑一：液體110mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體1mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑三：液體8mL×1瓶，4℃保存。

試劑四：液體1mL×1瓶，4℃避光保存。

樣品處理：

1.        組織：按照質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g，加入1mL試劑一）加入試劑一，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清待測(cè)。

2.        細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一）加入試劑一，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后于4℃，10000g離心10min，取上清待測(cè)。

3.        血清：直接測(cè)定。

測(cè)定操作：

計(jì)算公式：

a.        用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y= 0.1519 x -0.1241，R²=0.9994

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1μmol α-萘酚為一個(gè)酶活力單位。

HL活性（μmol /min/mg prot）= （△A+0.1241）÷0.1519×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

= 6.58×（△A+0.1241）÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每克組織每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1μmol α-萘酚為一個(gè)酶活力單位。

HL活性（μmol /min/g 鮮重）= （△A+0.1241）÷0.1519×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T

= 6.58×（△A+0.1241）÷W

3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1μmol α-萘酚為一個(gè)酶活力單位。

HL活性（μmol /min/10⁴ cell）= （△A+0.1241）÷0.1519×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T

                                      = 6.58×（△A+0.1241）÷細(xì)胞數(shù)量

4．按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1μmol α-萘酚為一個(gè)酶活力單位。HL活性（μmol /min/mL）=（△A+0.1241）÷0.1519×V反總÷V樣÷T

                                = 6.58×（△A+0.1241）

V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.02mL；W：樣本質(zhì)量，g；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10min

b．用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y= 0.076 x -0.1241，R²=0.9994

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1μmol α-萘酚為一個(gè)酶活力單位。

HL活性（μmol /min/mg prot）= （△A+0.1241）÷0.076×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

= 13.16×（△A+0.1241）÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每克組織每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1μmol α-萘酚為一個(gè)酶活力單位。

HL活性（μmol /min/g 鮮重）= （△A+0.1241）÷0.076×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T

= 13.16×（△A+0.1241）÷W

3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1μmol α-萘酚為一個(gè)酶活力單位。

HL活性（μmol /min/10⁴ cell）= （△A+0.1241）÷0.076×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T

                                      = 13.16×（△A+0.1241）÷細(xì)胞數(shù)量

4．按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1μmol α-萘酚為一個(gè)酶活力單位。HL活性（μmol /min/mL）=（△A+0.1241）÷0.076×V反總÷V樣÷T

                                = 13.16×（△A+0.1241）

V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.02mL；W：樣本質(zhì)量，g；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10min