β-淀粉酶（β-amylase，β-AL）試劑盒說明書

                                    微量法100管/48樣

注    意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

淀粉酶負責水解淀粉，主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)可隨機地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖。

測定原理：

還原糖還原3,5-二硝基水楊酸生成棕紅色物質。α-淀粉酶不耐酸，β-淀粉酶不耐熱。根據上述特性，鈍化其中之一，就可測出另一種淀粉酶的活力。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、恒溫水浴鍋、離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：30mL×1瓶，常溫保存，若有黃色晶體析出，需90℃加熱溶解后再用；

試劑二：15mL×1瓶，4℃保存，若出現沉淀析出，需70℃加熱溶解后再用。

粗酶液提取：

組織：稱取0.1~0.2g樣本（建議稱取約0.1g樣本），加入1mL蒸餾水，研磨勻漿；將勻漿倒入離心管中，提取液在室溫下放置提取15min，每5min振蕩1次，使其充分提??；3000g，25℃離心10min，取上清液加蒸餾水定容至10 mL，搖勻，即淀粉酶原液。

吸取上述淀粉酶原液1mL，加入4mL蒸餾水，搖勻，即為淀粉酶稀釋液，用于（α＋β）淀粉酶總活力的測定。

血清（漿）等液體樣本：（1）直接檢測α-淀粉酶。（2）吸取淀粉酶原液1mL，加入4mL蒸餾水，搖勻，即為淀粉酶稀釋液，用于（α＋β）淀粉酶總活力的測定。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長到540 nm，蒸餾水調零。

2、試劑一和試劑二40℃預熱10min.

3、測定操作表：

70℃水浴15min左右，冷卻

  40℃恒溫水浴中準確保溫5min

混勻，95度水浴5min，冷卻，取200μL 至微量石英比色皿或96孔板中，540nm處讀取吸光值，從左到右分別記為A1、A2、A3和A4。每個測定管需設一個對照管。

酶活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、標準條件下測定回歸曲線為y=3.7215x -0.1778； x為標準品濃度（mg/mL），y為吸光值。

2、α?淀粉酶活性

（1）按照樣本質量計算

單位定義：每g組織每分鐘催化產生1mg還原糖定義為1個酶活力單位。

α?淀粉酶活性(mg/min/g鮮重)=[(A2-A1＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=1.075×(A2-A1＋0.1778)÷W

（2）按照蛋白質含量計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1mg還原糖定義為1個酶活性單位。

α?淀粉酶活性(mg/min/mg prot)= [(A2-A1＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷（V樣×Cpr）÷T

=0.1075×(A2-A1＋0.1778) ÷Cpr

（3）血清（漿）等液體樣本中α?淀粉酶活性計算

單位定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產生1mg還原糖定義為1個酶活性單位。

α?淀粉酶活性(mg/min/mL)= [(A2-A1＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷V樣÷T=0.1075×(A2-A1＋0.1778)

3、總淀粉酶活性計算

（1）按照樣品質量計算

單位定義：每g組織每分鐘催化產生1mg還原糖定義為1個酶活力單位。

總淀粉酶活性(mg/min//g鮮重)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=5.375×(A4-A3＋0.1778)÷W

（2）按照蛋白質含量計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1mg還原糖定義為1個酶活力單位。

總淀粉酶活性(mg/min/mg prot)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷（V樣×Cpr）÷T

=0.5375×(A4-A3＋0.1778) ÷Cpr

（3）血清（漿）等液體樣本中總淀粉酶活性計算

單位定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產生1mg還原糖定義為1個酶活性單位。

總淀粉酶活性(mg/min/mL) =5×[(A4-A3＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷V樣÷T

=0.5375×(A4-A3＋0.1778)

4、β-淀粉酶活性計算

（1）按照樣本質量計算

單位定義：每g組織在反應體系中每分鐘催化產生1mg還原糖定義為1個酶活力單位。

β-淀粉酶活性(mg/min/g鮮重)=淀粉酶總活性-α-淀粉酶活性=[5.375×(A4-A3＋0.1778)-1.075×(A2-A1＋0.1778)]÷W

（2）按照蛋白質含量計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1mg還原糖定義為1個酶活力單位。

β-淀粉酶活性（mg/min/mg prot）=淀粉酶總活性-α-淀粉酶活性=[0.5375×(A4-A3＋0.1778)-0.1075×(A2-A1＋0.1778)]÷Cpr

（3）血清（漿）等液體樣本中β-淀粉酶活性計算

單位定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產生1mg還原糖定義為1個酶活性單位。

β-淀粉酶活性（mg/min/mL）=淀粉酶總活性-α-淀粉酶活性=0.5375×(A4-A3＋0.1778)-0.1075×(A2-A1＋0.1778)

5：總淀粉酶稀釋倍數；V反總：反應體系總體積，0.15mL；V樣：加入反應體系中樣本體積，0.075 mL；V樣總：提取液總體積，10 mL； Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，5min。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、標準條件下測定回歸曲線為y=2.481x -0.1778； x為標準品濃度（mg/mL），y為吸光值。

2、α?淀粉酶活性

（1）按照樣本質量計算

單位定義：每g組織每分鐘催化產生1mg還原糖定義為1個酶活力單位。

α?淀粉酶活性(mg/min/g鮮重)=[(ΔA＋0.1778)÷2.481×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=1.612×(ΔA＋0.1778)÷W

（2）按照蛋白質含量計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1mg還原糖定義為1個酶活性單位。

α?淀粉酶活性（mg/min/mg prot）=[(ΔA＋0.1778)÷2.481×V反總]÷（V樣×Cpr）÷T =0.1612×(ΔA＋0.1778) ÷Cpr

（3）血清（漿）等液體樣本中α?淀粉酶活性計算

單位定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產生1mg還原糖定義為1個酶活性單位。

α?淀粉酶活性（mg/min/mL）=[(ΔA＋0.1778)÷2.481×V反總]÷V樣÷T =0.1612×(ΔA＋0.1778)

3、總淀粉酶活性計算

（1）按照樣本質量計算

單位定義：每g組織每分鐘催化產生1mg還原糖定義為1個酶活力單位。

總淀粉酶活性(mg/min/g鮮重)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷2.481×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=8.06×(ΔA＋0.1778)÷W

（2）按照蛋白質含量計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1mg還原糖定義為1個酶活力單位。

總淀粉酶活性(mg/min/mg prot)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷2.481×V反總]÷（V樣×Cpr）÷T

=0.806×(A4-A3＋0.1778) ÷Cpr

（3）血清（漿）等液體樣本中總淀粉酶活性計算

單位定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產生1mg還原糖定義為1個酶活性單位。

總淀粉酶活性(mg/min/mL)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷2.481×V反總]÷V樣÷T

=0.806×(A4-A3＋0.1778)

4、β-淀粉酶活性計算

（1）按照樣本質量計算

單位定義：每g組織在反應體系中每分鐘催化產生1mg還原糖定義為1個酶活力單位。

β-淀粉酶活性(mg/min/g鮮重)=淀粉酶總活性-α-淀粉酶活性=[8.06×(A4-A3＋0.1778)-1.612×(A2-A1＋0.1778)]÷W

（2）按照蛋白質含量計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1mg還原糖定義為1個酶活力單位。

β-淀粉酶活性（mg/min/mg prot）=淀粉酶總活性-α-淀粉酶活性=[0.806×(A4-A3＋0.1778)-0.1612×(A2-A1＋0.1778)]÷Cpr

（3）血清（漿）等液體樣本中β-淀粉酶活性計算

單位定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產生1mg還原糖定義為1個酶活性單位。

β-淀粉酶活性（mg/min/mL）=淀粉酶總活性-α-淀粉酶活性=0.806×(A4-A3＋0.1778)-0.1612×(A2-A1＋0.1778)

5：總淀粉酶稀釋倍數；V反總：反應體系總體積，0.15mL；V樣：加入反應體系中樣本體積，0.075 mL；V樣總：提取液總體積，10 mL； Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，5min。