鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶(nithine-δ-aminotransferase ,δ-OAT)試劑盒說(shuō)明書

                                                    微量法100T/96S

注   意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

脯氨酸是植物體內(nèi)適應(yīng)逆境脅迫的一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。高等植物中脯氨酸代謝因其初始底物不同，分為谷氨酸( Glu) 和鳥(niǎo)氨酸( Orn) 兩條合成途徑。鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶( δ-OAT) 是 是以鳥(niǎo)氨酸為前體合成脯氨酸途徑的關(guān)鍵酶，對(duì)植物適應(yīng)逆境脅迫起關(guān)鍵作用。

測(cè)定原理：

鳥(niǎo)氨酸和α-酮戊二酸在鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶和NADH作用下發(fā)生氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成吡咯啉-5-羧酸（P5C），同時(shí)產(chǎn)生NAD，通過(guò)檢測(cè)340nm處的吸光度的變化可反映出鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性的高低。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、低溫離心機(jī)、研缽、酶標(biāo)儀、96孔板。

試劑組成和配制：

提取液：液體110mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體30 mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加8mL試劑一充分溶解；用不完的試劑4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加8mL試劑一充分溶解；用不完的試劑4℃保存。

試劑四：粉劑×2瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加4mL試劑一充分溶解；現(xiàn)配現(xiàn)用。

酶液提取：

1.        組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

2.        細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

3.        液體：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作：

1.        酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm。

2.        將配好的試劑二、三、四37℃預(yù)熱5min。（注意：粉劑試劑需要自行配制）

3.        取96孔板，依次加入60μL試劑二，60μL試劑三，60μL試劑四，20μL粗酶液，充分混勻，記錄340nm處初始吸光值和37℃反應(yīng)10min的吸光值A2，△A=A1-A2。

4.        計(jì)算公式：

用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

（1）按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

δ-OAT（nmol/min /mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T

=321.54×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

δ-OAT（nmol/min /g 鮮重）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T

=321.54×ΔA÷W

（3）按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

δ-OAT（nmol/min /10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總) ÷T

=321.54×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按照液體體積計(jì)算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

δ-OAT（nmol/min /mL）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T

=321.54×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g