苯胺-4-羥化酶（AH）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                                  微量法100管/48樣

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

細(xì)胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝。AH在P450酶系中相當(dāng)于CYP2E1亞型，CYP2E1不僅參與了藥物的代謝，而且還能催化多種前致癌物和前毒物的活化過(guò)程。

測(cè)定原理：

AH催化苯胺羥化后產(chǎn)生的4-氨基酚，進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)榉?/span>-吲哚復(fù)合物，在630nm處有特征吸收峰；通過(guò)測(cè)定630nm吸光度增加速率，來(lái)計(jì)算AH活性。

自備儀器及用品：

普通離心機(jī)、超速離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、雙蒸水和冰。

試劑組成和配制：

試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入100mL蒸餾水，充分溶解。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入10mL蒸餾水，充分溶解。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入5mL蒸餾水，充分溶解。

試劑五：液體×1瓶，4℃保存。

試劑六：粉劑×1瓶（腐蝕性試劑），4℃避光保存。臨用前加入10mL蒸餾水，充分溶解。

試劑七：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入10mL蒸餾水充分溶解。

標(biāo)準(zhǔn)液：液體×1瓶，10μmol/L，4℃避光保存。

粗酶液提?。?/span>

1、除去細(xì)胞核，線粒體等大分子物質(zhì)：稱約0.5g組織，加入1mL試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃，離心30min，取上清液，轉(zhuǎn)移到超速離心管中。

2、粗制微粒體： 100 000g 4℃，離心60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟2的沉淀中加1mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。

4、最終微粒體：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5mL，蓋緊后充分震蕩溶解，即粗酶液，待測(cè)。

測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到630 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑三置于37℃水浴中預(yù)熱30min。

3. 試劑五置于冰浴預(yù)冷30min。

4. 標(biāo)準(zhǔn)管：取0.5 mL EP管，加入100μL標(biāo)準(zhǔn)液，100μL試劑六，100μL試劑七，混勻后室溫靜置30min，吸取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，630 nm測(cè)定光吸收，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

5. 對(duì)照管：取0.5 mL EP管，加入50μL粗酶液，100μL試劑三，50μL蒸餾水，混勻后37℃水浴中保溫30min；再加入100μL試劑五，混勻后冰浴5min，11000rpm，4℃，離心10min；取100μL上清液，加入新的0.5 mL EP管；再加入100μL試劑六，100μL試劑七，混勻后室溫靜置30min，吸取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，630 nm測(cè)定光吸收，記為A對(duì)照管。

6. 測(cè)定管：取0.5 mL EP管，加入50μL粗酶液，100μL試劑三，50μL試劑四，混勻后37℃水浴中保溫30min；再加入100μL試劑五，混勻后冰浴5min，11000rpm，4℃，離心10min；取100μL上清液，加入新的0.5 mL EP管；再加入100μL試劑六，100μL試劑七，混勻后室溫靜置30min，吸取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，630 nm測(cè)定光吸收，記為A測(cè)定管。

AH活性計(jì)算公式：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 4-氨基酚為1個(gè)酶活單位。

AH活性(nmol/min/mg prot) = C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T

= 2×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr。

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：37℃中每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 4-氨基酚為1個(gè)酶活單位。

AH活性(nmol/min/g 鮮重)= C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷(W×V樣)÷T

= 2×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷W

C標(biāo)準(zhǔn)品：10μmol/L；V標(biāo)準(zhǔn)品：100μL=1×10^-4L；稀釋倍數(shù)： V反總÷V上清液=300μL÷100μL=3；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積， 50μL=0.05 mL； T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），30min。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 4-氨基酚為1個(gè)酶活單位。

AH活性(nmol/min/mg prot) = C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T

= 2×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：37℃中每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 4-氨基酚為1個(gè)酶活單位。

AH活性(nmol/min/g 鮮重) = C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷(W×V樣)÷T

= 2×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷W

C標(biāo)準(zhǔn)品：10μmol/L；V標(biāo)準(zhǔn)品：100μL=1×10^-4L；稀釋倍數(shù)：V反總÷V上清液=300μL÷100μL=3；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒； W ：樣品質(zhì)量； V樣：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積， 50μL=0.05 mL； T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），30min。